NextSeq500/550和Miniseq平台进行低多样性文库测序的最佳操作

06/26/2022


若希望低多样性文库在NextSeq500/550和Miniseq平台上获得精确和稳定的测序结果,需要精心设计的实验以及良好的生信分析。低多样性文库最常见的例子是基于扩增方法制备的文库,例如16S扩增子文库。这些文库扩增引物结合的位置,即起始位点的DNA序列基本是相同的。单一的位点会导致碱基组成不平衡,以至于碱基组成从一个循环到下一个循环可能会发生剧烈变化。

NextSeq500/550和Miniseq系统使用的是双通道测序技术。因此,确保每个循环中均存在4种DNA碱基是非常重要的,这样分析软件才能正确鉴定DNA簇并精确读取碱基序列。使用低多样性文库时,为了满足这种要求,我们建议在设计实验时,采用以下几种方法保证每个循环的多样性。

  • 利用标签区分技术,在测序中加入多个带有标签的来自多种应用的样品。

o   那些来自多样性较高的应用的带有标签的样品,例如人类扩增子测序、富集或者全基因组测序文库,都能够用来增加文库碱基多样性。

o   为了最佳测序结果,可以利用单标签或者双标签技术,将多个样品在同一张Flow Cell上进行测序。

o   可以加入50% PhiX为初始掺入比例,然后根据一级分析和二级分析的结果,逐步降低PhiX掺入比例。掺入这样的样品能提供每个循环必需的碱基多样性。

  • 对于NextSeq和MiniSeq系统,建议测序时簇密度低于平衡库(如PhiX)建议的最佳簇密度的30-40%。

o   Miniseq试剂建议平衡文库的原始簇密度最佳范围为170-220 K/mm2。

o   NextSeq500/550试剂建议平衡文库的原始簇密度最佳范围为170-220 K/mm2。

本文上述中的这些建议能够使得NextSeq500/550和Miniseq平台进行低多样性文库测序。