01/13/2023
在Illumina测序平台上利用定制引物对制备好的文库进行测序时，需要对其进行优化，以保证测序正常进行。当定制样本与PhiX或其它Illumina标准文库混合测序时，需要将定制引物与Illumina引物合并，或者将定制引物掺入到Illumina引物中。Illumina无法保证定制引物是否作用或者兼容，需要客户自己验证这些引物是可以在特定平台上进行测序。当使用定制测序引物时，最关键是需要了解基于平台推荐的装载浓度，总的体积，装载位置以及 引物退火温度。该技术文档为如何将定制引物掺入到Illumina测序引物中提供了相关信息。
将定制引物掺入到Illumina引物中
*可以用(C1)(V1) = (C2)(V2)等式计算需要掺入多少定制引物到对应孔里:
C1=您定制引物的浓度（当使用高浓度引物储存液时，例如100uM，相对于最终的体积，额外增加的体积非常小，可以忽略）
V1=掺入定制引物的体积
C2=参考下面表格中推荐的定制引物的终浓度
V2=参考下面表格中Illumina引物的总体积
例如: (100uM * V1) = (0.5uM * 680uL)
V1 = 3.4 µL
**MiSeq、NextSeq和MiniSeq试剂槽：为了提高Illumina测序引物体积测定以及定制引物掺入和混匀的成功率，建议使用较细的枪头或者较大体积的低浓度定制引物。
重要说明: 以下指导资料是基于目前引物的体积。为了确保准确性，在进行操作前，请先测定试剂槽中引物的总体积。
iSeq 100
随着iSeq 控制软件3.0的发布，现在iSeq100也可以用定制引物测序。由于iSeq试剂卡盒的构造原因，我们无法直接将定制引物提前加入到Illumina 引物中。
不同于将定制引物直接混入试剂卡盒的引物孔中，iSeq 100定制引物测序需要用到NextSeq 1000/2000 Custom Primer试剂盒，并且该试剂盒配置是兼容iSeq 100的。定制引物需要先添加到适当Illumina引物中，然后按照iSeq 100定制引物流程添加到试剂卡盒中。对于NextSeq 1000/2000 Custom Primer试剂盒的说明和货号，请查阅 NextSeq 1000/2000 Custom Primers Guide.
重要说明：NextSeq 1000/2000定制引物指南提供了针对NextSeq 1000/2000的引物添加说明。对于iSeq100定制引物的添加请参阅以下说明。
| Kit version | Illumina Primer (name) | Cartridge Position |
Total Volume (µL) |
Custom primer final concentration (µM) |
|---|---|---|---|---|
| i1 v2 | Read 1 (HP21) | NA | 140 | 0.3 |
| Index 1 (i7) (BP14) | NA | 140 | 0.6 | |
| Index 2 (i5) (BP14) | NA | 140 | 0.6 | |
| Read 2 (HP21) | NA | 140 | 0.3 |
MiniSeq
由于MiniSeq上独特的双标签测序流程，定制引物与Illumina引物的组合有一定限制。需要注意定制引物的从属关系，请参考相应文档。
| Kit version | Illumina Primer (name) | Cartridge Position |
Total Volume (µL) |
Custom primer final concentration (µM) |
|---|---|---|---|---|
| Rapid Run 100 Cycles |
Read 1 (BP10) | 24 | 590 | 0.3 |
| Read 2 (BP11) | 25 | 530 | 0.3 | |
| Index 1 (i7) and Index 2 (i5) (BP14) | 28 | 740 | 0.3 | |
| High Output 75 Cycles |
Read 1 (BP10) | 24 | 550 | 0.3 |
| Read 2 (BP11) | 25 | 610 | 0.3 | |
| Index 1 (i7) and Index 2 (i5) (BP14) | 28 | 820 | 0.3 | |
| High Output 150 Cycles |
Read 1 (BP10) | 24 | 550 | 0.3 |
| Read 2 (BP11) | 25 | 610 | 0.3 | |
| Index 1 (i7) and Index 2 (i5) (BP14) | 28 | 857 | 0.3 | |
| High Output 300 Cycles |
Read 1 (BP10) | 24 | 550 | 0.3 |
| Read 2 (BP11) | 25 | 610 | 0.3 | |
| Index 1 (i7) and Index 2 (i5) (BP14) | 28 | 820 | 0.3 | |
| Mid Output 300 Cycles |
Read 1 (BP10) | 24 | 550 | 0.3 |
| Read 2 (BP11) | 25 | 610 | 0.3 | |
| Index 1 (i7) and Index 2 (i5) (BP14) | 28 | 820 | 0.3 |
MiSeq
| Kit version | Illumina Primer (name) | Cartridge Position |
Total Volume (µL) |
Custom primer final concentration (µM) |
|---|---|---|---|---|
| v2 and v3 | Read 1 (HP10) | 12 | 680 | 0.5 |
| Index 1 (i7) (HP12)* | 13 | 680 | 0.5 | |
| Read 2 (HP11) | 14 | 680 | 0.5 |
* 由于模板使用流动槽(Flowcell)表面偶联的P5引物为测序引物，因此无法使用Index2(i5)定制引物。
NextSeq 500/550
由于NextSeq上独特的双标签测序流程，定制引物与Illumina引物的组合有一定限制。需要注意定制引物的从属关系，请参考相应文档 。
| Kit version | Illumina Primer (name) | Cartridge Position |
Total Volume (mL) |
Custom primer final concentration (µM) |
|---|---|---|---|---|
| High Output 75 cycles |
Read 1 (BP10) | 20 | 1.72 | 0.3 |
| Read 2 (BP11) | 21 | 1.98 | 0.3 | |
| Index 1 (i7) and Index 2 (i5) (BP14) | 22 | 2.83 | 0.3 | |
| High Output 150 Cycles |
Read 1 (BP10) | 20 | 1.73 | 0.3 |
| Read 2 (BP11) | 21 | 1.98 | 0.3 | |
| Index 1 (i7) and Index 2 (i5) (BP14) | 22 | 2.83 | 0.3 | |
| High Output 300 Cycles |
Read 1 (BP10) | 20 | 1.73 | 0.3 |
| Read 2 (BP11) | 21 | 1.98 | 0.3 | |
| Index 1 (i7) and Index 2 (i5) (BP14) | 22 | 2.83 | 0.3 | |
| Mid Output 150 Cycles |
Read 1 (BP10) | 20 | 1.34 | 0.3 |
| Read 2 (BP11) | 21 | 1.51 | 0.3 | |
| Index 1 (i7) and Index 2 (i5) (BP14) | 22 | 2.09 | 0.3 | |
| Mid Output 300 Cycles |
Read 1 (BP10) | 20 | 1.33 | 0.3 |
| Read 2 (BP11) | 21 | 1.52 | 0.3 | |
| Index 1 (i7) and Index 2 (i5) (BP14) | 22 | 2.09 | 0.3 |
NextSeq 1000/2000
由于NextSeq 1000/2000试剂卡盒的构造原因，无法直接将定制引物加入到Illumina测序引物中。
如果在测序文库中有Phix需要用到Illumina测序引物，就需要用到NextSeq 1000/2000 Custom Primer试剂盒。具体请参阅NextSeq 1000/2000 Custom Primers Guide。
HiSeq 1000/1500/2000/2500
| Kit version | Illumina Primer (name) | Position | Total Volume (mL) |
Custom primer final concentration (µM) |
|---|---|---|---|---|
| High Output v4 | Read 1 (HP10) | cBot plate - Row 2 | 0.3 per tube | 0.5 |
| Index 1 (i7) (HP12) | PE rack - 17 | 2.5 | 0.5 | |
| Index 2 (i5) (HP9) on a single read run* |
PE rack - 16 | 2.5 | 0.5 | |
| Read 2 (HP11) | PE rack - 16 | 2.5 | 0.5 | |
| High Output v3 | Read 1 (HP6) | cBot plate - Row 11 | 0.3 per tube | 0.5 |
| Index 1 (i7) (HP8 or HP12) | PE rack - 17 | 3.15 | 0.5 | |
| Index 2 (i5) (HP9) on a single read run* |
PE rack - 16 | 3.15 | 0.5 | |
| Read 2 (HP7 or HP11) | PE rack - 16 | 3.15 | 0.5 | |
| Rapid Run v2 | Read 1 (HP10) | PE rack - 18 | 1.93 | 0.5 |
| Index 1 (i7) (HP12) | PE rack - 17 | 1.93 | 0.5 | |
| Index 2 (i5) (HP9) on a single read run* |
PE rack - 16 | 1.93 | 0.5 | |
| Read 2 (HP11) | PE rack - 16 | 1.93 | 0.5 |
* 由于模板使用流动槽(Flow Cell)表面偶联的P5引物为测序引物，因此无法使用Index2(i5)定制引物。
HiSeq 3000/4000
| Kit version | Illumina Primer (name) | Position | Total Volume (mL) |
Custom primer final concentration (µM) |
|---|---|---|---|---|
| High Output | Read 1 (HP10) | cBot plate - Row 11 | 0.39 per tube | 0.5 |
| Index 1 (i7) and Index 2 (i5) (HP14) |
PE rack - 17 | 4.31 | 0.5 | |
| Read 2 (HP11) | PE rack - 16 | 2.64 | 0.5 |
NovaSeq
由于NovaSeq上的引物设计和双标签测序流程，定制引物与Illumina引物的组合有一定限制。需要注意定制引物的从属关系，请参考文档。
NovaSeq v1.0 Consumables
| Kit version | Illumina Primer (name) | Cartridge Position |
Total Volume (mL) |
Custom primer final concentration (µM) |
|---|---|---|---|---|
| SP 100/200/300/500 cycles |
Read 1 (BP10) | 24 | 4 | 0.3 |
| Index 1 (i7) (BP14)* | 23 | 5 | 0.3 | |
| Read 2 (BP11) | 13 | 2 | 0.3 | |
| S1 and S2 100/200/300 cycles |
Read 1 (BP10) | 24 | 4 | 0.3 |
| Index 1 (i7) (BP14)* | 23 | 5 | 0.3 | |
| Read 2 (BP11) | 13 | 2 | 0.3 | |
| S4 200/300 cycles |
Read 1 (BP10) | 24 | 7.3 | 0.3 |
| Index 1 (i7) (BP14)* | 23 | 5 | 0.3 | |
| Read 2 (BP11) | 13 | 3.5 | 0.3 |
*由于模板使用流动槽(Flow Cell)表面偶联的P5引物为测序引物，因此无法使用Index2(i5)定制引物。
NovaSeq v1.5 Consumables
| Kit version | Illumina Primer (name) | Cartridge Position |
Total Volume (mL) |
Custom primer final concentration (µM) |
|---|---|---|---|---|
| SP 100/200/300/500 cycles |
Read 1 (VP10) | 24 | 4 | 0.3 |
| Index 1 (i7) and Index 2 (i5) (VP14) | 23 | 5 | 0.3 | |
| Read 2 (VP11) | 13 | 2 | 0.3 | |
| S1 and S2 100/200/300 cycles |
Read 1 (VP10) | 24 | 4 | 0.3 |
| Index 1 (i7) and Index 2 (i5) (VP14) | 23 | 5 | 0.3 | |
| Read 2 (VP11) | 13 | 2 | 0.3 | |
| S4 200/300 cycles |
Read 1 (VP10) | 24 | 7.3 | 0.3 |
| Index 1 (i7) and Index 2 (i5) (VP14) | 23 | 5 | 0.3 | |
| Read 2 (VP11) | 13 | 3.5 | 0.3 |
使用定制引物替代Illumina引物
如果仅需要定制引物，可以用定制引物替代Illumina引物。当仅使用定制引物时，设置运行程序的说明，可以参考以下文档：
关于各个平台标签测序的更多信息，请参考文档Indexed Sequencing Overview Guide.